細胞培養(yǎng)中的那些問題

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       做細胞培養(yǎng)的同學(xué)如果互相交流會發(fā)現(xiàn)，不同的實驗室有些規(guī)則是不一樣的，初學(xué)者經(jīng)常不知對錯，小編今天就和大家總結(jié)一下這些問題，希望對你的細胞之路有所幫助。

購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形？

研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

有必要做熱滅活嗎?

實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點"，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。

細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應(yīng)馬上去除DMSO？ 

除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

DMSO之等級和無菌過濾之方式為何？

冷凍保存使用之DMSO等級，必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于4 C，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染之機會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO之Nylon材質(zhì)濾膜。

可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細胞大都無法立即適應(yīng)，造成細胞無法存活。

可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？

不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 %原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。

細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細胞濃度？

冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

 L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？ 

GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解。

血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理？

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞您的過濾膜。

為什么要熱滅活血清? 

加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細胞，昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。

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