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　　本生帶您了解：ELISA實驗中常見問題和注意事項
 

　　用于(yu)ELISA測(ce)(ce)定(ding)的(de)(de)臨床(chuang)標(biao)本最為常用的(de)(de)是血清(漿(jiang))。本實驗室用ELISA測(ce)(ce)定(ding)乙肝兩(liang)對半，甲肝，戊肝，抗HIV的(de)(de)標(biao)本時，在處理和保(bao)存方面要考慮(lv)以下幾個方面：

　　1)要注(zhu)意避免(mian)出現(xian)嚴重溶(rong)(rong)血及血清中(zhong)混(hun)有(you)(you)紅細(xi)胞。當(dang)標本出現(xian)嚴重溶(rong)(rong)血及血清中(zhong)混(hun)有(you)(you)紅細(xi)胞時，反應孔(kong)不易洗(xi)凈，殘留在反應孔(kong)內的血紅蛋(dan)白(bai)具有(you)(you)過氧化物酶的活性，顯色(se)時可能(neng)造(zao)成假陽性。

　　2)標本凝固不全強行離心，造成(cheng)血清(qing)中(zhong)含有少(shao)量的纖(xian)維蛋白(bai)原，在實驗過程中(zhong)形成(cheng)纖(xian)維蛋白(bai)吸附在反應孔孔壁(bi)上不易洗掉(diao)，易造成(cheng)假性結果。

　　3)血(xue)清標(biao)(biao)本可在2～8℃下保存(cun)1周(zhou)。如血(xue)清樣本需長時間保存(cun)，則需放入-20℃冰柜內冰凍(dong)保存(cun)。冰凍(dong)保存(cun)的(de)血(xue)清標(biao)(biao)本須注意(yi)避免反(fan)復凍(dong)融，標(biao)(biao)本可能引起假陰(yin)性(xing)結果。此外凍(dong)融標(biao)(biao)本的(de)混(hun)勻(yun)不要(yao)進(jin)行劇烈振(zhen)蕩，應反(fan)復顛倒(dao)混(hun)勻(yun)。

　　ELISA測定中試劑準備：

　　在實驗(yan)開始前，將(jiang)試(shi)劑盒先從(cong)冰箱(xiang)(xiang)中(zhong)拿出來，在室溫(wen)下放置20分鐘以上(shang)后，再進(jin)行(xing)測定(ding)，證試(shi)劑盒溫(wen)度要和(he)室溫(wen)一(yi)致。如果把試(shi)劑盒從(cong)冰箱(xiang)(xiang)拿出來直(zhi)接做實驗(yan)會造(zao)成一(yi)些弱(ruo)陽性(xing)標本的(de)檢測出現(xian)假陰性(xing)。因為在后面的(de)孵育反應步驟(zou)中(zhong)，造(zao)成孵育時間不夠。其(qi)次，ELISA實驗(yan)中(zhong)洗(xi)(xi)板用的(de)洗(xi)(xi)液需(xu)每日更換配(pei)制，稀釋時所用的(de)蒸餾水或去離子水應保證質量。

　　加血清樣本及反應試劑：

　　血清樣(yang)本使用(yong)微(wei)量加(jia)(jia)樣(yang)槍加(jia)(jia)樣(yang)。使用(yong)微(wei)量加(jia)(jia)樣(yang)槍加(jia)(jia)樣(yang)必須注意避免以下幾點(dian)：

　　1)加樣太快(kuai)，無法保證微(wei)量加樣的準(zhun)確性和均一性。需(xu)勻速加樣，吸樣時(shi)，加樣槍(qiang)需(xu)按到第(di)一檔，加樣時(shi)，加樣槍(qiang)需(xu)直接按到底。

　　2)加樣應(ying)直(zhi)接加入反應(ying)孔底部(bu)，加在(zai)反應(ying)孔孔壁上易濺出會對(dui)鄰近孔產生污(wu)染。盡量避(bi)免出現氣泡。

　　3)反應試劑的(de)加入時先要注意試劑的(de)有效期(qi)，再注意滴(di)加的(de)角度(du)和滴(di)加的(de)速度(du)。滴(di)加太快易出現重復(fu)滴(di)加或加在兩孔之間。

　　溫育的時間與溫度：

　　溫育(yu)(yu)是ELISA測定(ding)中(zhong)最容易(yi)出現問題的步驟。溫育(yu)(yu)溫度應(ying)在37℃，水浴。溫育(yu)(yu)時間(jian)應(ying)按照(zhao)試劑說明書上(shang)的時間(jian)嚴格執行(xing)。溫育(yu)(yu)實際測定(ding)操(cao)作中(zhong)要注意以(yi)下幾點：

　　1)要保證在(zai)設(she)定的溫度下有足夠的反應時(shi)(shi)間。溫育(yu)時(shi)(shi)間不(bu)(bu)夠，弱陽性樣本測(ce)不(bu)(bu)出來。

　　2)因為采(cai)用水(shui)浴，所以在溫育(yu)時(shi)一定要(yao)封(feng)板(ban)，防(fang)止水(shui)蒸氣形成(cheng)水(shui)滴(di)掉入(ru)反(fan)應孔內造成(cheng)污染，并(bing)有可(ke)能整板(ban)花(hua)板(ban)。

　　ELISA測定的洗板：

　　全(quan)自動洗板機的使用應注(zhu)意以下幾點：

　　1)洗板前，應檢(jian)查(cha)洗液(ye)瓶、蒸餾水瓶是否充足，廢液(ye)瓶是否滿(man)瓶

　　2)在自(zi)檢過程中注意觀察洗(xi)液灌注是否通暢，排液是否通暢。

　　3)在洗(xi)板(ban)過程(cheng)中(zhong)，應注意觀(guan)察反應孔每孔是否(fou)灌滿且無(wu)外溢，每孔吸(xi)(xi)水是否(fou)吸(xi)(xi)盡(jin)，并且要保證洗(xi)液在孔中(zhong)放置的時間。

　　BUNSEN本生提醒(xing)：ELISA測(ce)定以TMB為底物的顯色

　　加(jia)入底(di)(di)物開始顯色(se)反(fan)應前，最(zui)(zui)好是(shi)先檢查一下底(di)(di)物溶液(ye)的有效(xiao)期。滴入A、B顯色(se)劑后(hou)，需溫(wen)育(yu)15min，最(zui)(zui)后(hou)加(jia)入終止(zhi)液(ye)終止(zhi)反(fan)應，振蕩(dang)混勻(yun)后(hou)即可進行下面的比色(se)測定判斷結果。在此過程中應注意不要把顯色(se)劑和終止(zhi)液(ye)滴入順序弄(nong)反(fan)，否(fou)則重做實驗。

　　ELISA的比色測定

　　ELISA的比色測定由酶標儀進(jin)行測定，故需強(qiang)調比色測定時(shi)，一定要(yao)注(zhu)意酶標儀的波(bo)長(chang)是(shi)否是(shi)雙波(bo)長(chang)(450nm和630nm)。

　　ELISA測定結果判定

　　結(jie)果判定一般是根(gen)據比色結(jie)果和(he)肉眼觀(guan)察綜合判定。如在判定過程發(fa)現(xian)(xian)有些反應孔出(chu)現(xian)(xian)倒(dao)陰不(bu)陽(yang)(yang)的(de)現(xian)(xian)象或出(chu)現(xian)(xian)不(bu)常見的(de)模式(shi)(如乙肝兩對半中出(chu)現(xian)(xian)12陽(yang)(yang)性等)，需本(ben)著嚴謹的(de)態度，重(zhong)新(xin)復查。

　　對(dui)ELISA測(ce)定(ding)中(zhong)出現問題的可能原因(非(fei)試(shi)劑盒本身的原因)，總結如下：

　　1)弱陽性質控樣本檢測不(bu)出溫育(yu)的時(shi)間或溫度不(bu)夠(gou);顯色反應時(shi)間太短;所用(yong)配(pei)制(zhi)緩沖(chong)液的蒸餾水有問題(ti)。

　　2)測(ce)定的(de)(de)重(zhong)復性(xing)差，這(zhe)是由(you)于測(ce)定操(cao)作引(yin)起的(de)(de)問題，包括

　　①加(jia)樣本及(ji)試劑量(liang)不準;孔(kong)間(jian)不一(yi)致

　　②加樣(yang)過(guo)快，孔間發(fa)生污染(ran)

　　③加錯樣本

　　④加樣本及試劑時(shi)，加在孔壁

　　⑤不(bu)同批號試劑盒中(zhong)組分混用

　　⑥溫育(yu)時間(jian)、洗板、顯色時間(jian)不一致

　　⑦孔內(nei)污染雜物，

　　血(xue)清標本(ben)未凝(ning)固即加入(ru)，反(fan)應孔內出(chu)現(xian)纖維蛋白凝(ning)固或殘(can)留血(xue)細胞，易出(chu)現(xian)假陽性等。

　　3)全部孔都不顯色

　　①漏(lou)加酶結合物;

　　②洗板液配制中出現問題

　　③漏加顯色(se)劑(ji)A或B

　　④終止劑(ji)當(dang)顯色劑(ji)使用

　　4)全部板孔均(jun)有顯色

　　①板不干凈

　　②顯色液變質

　　③洗板液受酶(mei)等污染(ran)

　　ELISA試(shi)劑盒 本(ben)生(sheng)(sheng)一(yi)直視質(zhi)量控制為企(qi)業的(de)生(sheng)(sheng)命，追求企(qi)業競(jing)爭力的(de)不斷提升。公司(si)在(zai)經(jing)營(ying)中始(shi)終秉(bing)承(cheng)：遵紀守法，嚴于律(lv)己，寬仁以待，敢(gan)于承(cheng)擔的(de)企(qi)業精(jing)神作為標準(zhun)，以過(guo)硬的(de)質(zhi)量和優(you)良的(de)服務(wu)來維護和拓展(zhan)市場，較大(da)限度(du)的(de)滿足客(ke)戶(hu)的(de)需求。與(yu)客(ke)戶(hu)的(de)共(gong)贏，是我們的(de)發展(zhan)目標。本(ben)生(sheng)(sheng)!您(nin)信任的(de)合作伙伴。我們愿與(yu)您(nin)真(zhen)誠合作，共(gong)創美好的(de)未(wei)來。